關(guān)鍵詞：Phase Ⅰ Metabolism，Metabolic Stability，CytochromeP450，CYP450，Liver microsomes，Primary hepatocytes

藥物代謝又稱生物轉(zhuǎn)化(biotransformation)，是指藥物被機(jī)體吸收后，在體內(nèi)各種酶以及體液環(huán)境作用下發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變的過程。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化可分為Ⅰ相代謝反應(yīng)（Phase Ⅰ Metabolism）和Ⅱ相代謝反應(yīng)（Phase Ⅱ Metabolism），兩種類型的反應(yīng)都得到極性更強(qiáng)、水溶性更好的產(chǎn)物，因此它們更易通過膽汁和尿被排泄出體外。代謝穩(wěn)定性（Metabolic Stability）反映了化合物對生物轉(zhuǎn)化的敏感性，它會影響化合物的口服生物利用度以及體內(nèi)半衰期，進(jìn)而影響到化合物在體內(nèi)的安全性和有效性。因此，在藥物研發(fā)初期，有必要對藥物的代謝穩(wěn)定性情況進(jìn)行考察。與體內(nèi)代謝穩(wěn)定性研究相比，藥物體外代謝穩(wěn)定性研究可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響，有助于更直接地觀察藥物的代謝特征，具有省時、穩(wěn)定、高效的特點，可用于候選藥物的高通量篩選。本文簡要介紹藥物體外Ⅰ相代謝穩(wěn)定性體外研究方法及數(shù)據(jù)分析，以供參考。

一、藥物Ⅰ相代謝介紹

藥物Ⅰ相代謝（Phase Ⅰ Metabolism）是指藥物分子上引入新的基團(tuán)或除去原有小基團(tuán)的官能團(tuán)反應(yīng)，包括氧化、還原和水解等反應(yīng)。Ⅰ相代謝反應(yīng)中最重要的酶系是細(xì)胞色素P450（CytochromeP450，CYP450），屬于單加氧酶（momooxygenase），主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中，能催化烷烴、烯烴、芳烴和類固醇等多種物質(zhì)進(jìn)行氧化反應(yīng)。該酶系由細(xì)胞色素P450和NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃素蛋白）偶合組成，需要分子氧和還原輔酶Ⅱ（NADPH）參與反應(yīng)，催化基本反應(yīng)為：

單加氧酶能直接激活氧分子，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物，另一個氧原子則被NADPH還原為水。由于一個氧分子發(fā)揮了兩種功能，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物，所以又稱為羥化酶。單加氧酶的反應(yīng)過程見圖1：

圖1 單加氧酶的反應(yīng)過程

此外，參與Ⅰ相代謝過程還原反應(yīng)的酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類；參與水解反應(yīng)的酶包括酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分別催化酯類、酰胺類、糖苷類化合物的水解以降低或消除其生物活性。

由此可見，Ⅰ相代謝是藥物代謝的重要環(huán)節(jié)，通過Ⅰ相代謝反應(yīng)，藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，例如引入或暴露某些官能團(tuán)（如羥基、氨基等）。這些結(jié)構(gòu)改變會使藥物的性質(zhì)產(chǎn)生變化，影響其藥理活性、毒性以及藥代動力學(xué)特征等。它在藥物研發(fā)、藥物療效和安全性評估等方面都有著關(guān)鍵意義，如果藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性較差，可能導(dǎo)致在體內(nèi)過快或過慢地代謝，從而影響藥物的有效性和安全性。因此，了解待測化合物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性對于選擇具有良好藥代動力學(xué)特征的候選藥物至關(guān)重要。

二、藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性體外研究方法

由于肝臟是藥物代謝的重要器官，是機(jī)體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要場所，富含參與藥物Ⅰ相代謝反應(yīng)的各種酶，因此，藥物體外代謝穩(wěn)定性研究多以肝臟為模型。較常使用的肝臟體外代謝模型有肝微粒體（Liver microsomes）和原代肝細(xì)胞（Primary hepatocytes）等。

（1）肝微粒體體外溫孵法試驗方法     

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相代謝酶，其中最重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)，在用肝微粒體進(jìn)行研究時，如加入相應(yīng)的輔助因子NADPH，則可重組體外代謝體系，從而通過體外溫孵法進(jìn)行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究。

① 樣本準(zhǔn)備：肝微粒體（人、猴、犬、大鼠、小鼠等種屬），試驗體系中微粒體蛋白終濃度建議是在0.1mg/mL-1mg/mL之間；待測藥物終濃度一般為1μM，不建議過高。

② 溫孵反應(yīng)：將肝微粒體、測試藥物溶液以及NADPH再生系統(tǒng)混合于合適的反應(yīng)容器（如小型離心管）中。通常反應(yīng)體系的體積在200-500μL左右。將反應(yīng)容器置于37°C環(huán)境中孵育一定時間，如0，5，10，15，30，60 min。每個樣品平行3次，同時需設(shè)置空白對照組、陰性對照組和陽性對照組。

③ 終止反應(yīng)與樣本處理：孵育結(jié)束后，可通過加入有機(jī)溶劑（如乙腈等）進(jìn)行終止反應(yīng)。然后通過離心等手段進(jìn)行樣本處理，離心條件如13000-15000 rpm離心5-10分鐘，然后取上清液進(jìn)行檢測。

④ 檢測分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技術(shù)檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而分析藥物的半衰期及固有清除率，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩(wěn)定性。圖2為采用LC-MS/MS測定某種藥物在人、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況，從圖上可知，該藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝，但不同種屬間又存在顯著差異。

圖2某種藥物在人、犬、大鼠肝微粒體中的代謝情況

（2）原代肝細(xì)胞體外溫孵法試驗方法

原代肝細(xì)胞保持了完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，擁有更完整的代謝酶系統(tǒng)和不同清除途徑的輔酶因子?？刹捎迷渭?xì)胞體外溫孵法進(jìn)行藥物代謝穩(wěn)定性試驗。

① 原代肝細(xì)胞獲取與準(zhǔn)備：可以從新鮮肝臟組織通過機(jī)械和酶消化等方法獲取原代肝細(xì)胞（人、猴、犬、大鼠及小鼠等種屬）。分離得到的肝細(xì)胞要進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，只有活力較高（一般要求在80%以上）的細(xì)胞才適合用于后續(xù)試驗。反應(yīng)體系中原代肝細(xì)胞的濃度可在0.5-2×106/mL之間調(diào)整。

② 溫孵反應(yīng)：將原代肝細(xì)胞和測試藥物（建議終濃度為1μM）于適合的條件（如37℃、5% CO?）下進(jìn)行孵育一定時間，如0、15、30、60、90、120min。

③ 終止反應(yīng)與樣本處理：孵育結(jié)束后，可通過加入有機(jī)溶劑（如乙腈等）進(jìn)行終止反應(yīng)。樣本離心后取上清液進(jìn)行檢測。

④ 檢測分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技術(shù)檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而分析藥物的半衰期及固有清除率，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩(wěn)定性。

由此可見，肝微粒體和原代肝細(xì)胞都可通過體外溫孵法進(jìn)行藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究。兩者的區(qū)別如下所示，客戶可根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇。

【肝微粒體使用場景及選擇】

√ 化合物分子水溶性較強(qiáng)，強(qiáng)烈推薦選擇肝微粒體。

√Ⅰ相代謝為主要代謝途徑(尤其是經(jīng)由CYP450酶代謝)等情況下，強(qiáng)烈推薦選擇肝微粒體。

√ 肝微粒體成本相對較低、易于儲存和使用，操作簡便，適用于大量化合物的初步篩選、評估化合物代謝穩(wěn)定性、指導(dǎo)結(jié)構(gòu)修飾等研究。

√ 肝微粒體缺乏完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無法模擬藥物的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，試驗結(jié)果可能與體內(nèi)實際情況存在一定差異，需要結(jié)合其他試驗方法進(jìn)行綜合評估。

【原代肝細(xì)胞適用場景及選擇】

√ 肝微粒體中非特異性蛋白結(jié)合較高時，可選擇原代肝細(xì)胞。

√ 肝微粒體體中代謝不明顯時，可嘗試使用原代肝細(xì)胞。

√ 化合物主要經(jīng)由醛氧化酶（AO）或者單胺氧化酶（MAO）等非CYP450氧化酶代謝或者水解反應(yīng)為主要代謝途徑時，可選擇原代肝細(xì)胞。

√ Ⅱ相代謝為主要途徑時，選擇原代肝細(xì)胞。

√ 原代肝細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和各類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，更適用于需要模擬真實體內(nèi)代謝環(huán)境、評估藥物口服生物利用度、預(yù)測人體清除率等研究。但原代肝細(xì)胞試驗成本較高，操作相對復(fù)雜，對實驗條件要求較高。

三、IPHASE 體外Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)分析

1.代謝正常

一般情況下，體外代謝穩(wěn)定性試驗的要求是：如果藥物發(fā)生了代謝，則R2>0.9；3個平行數(shù)據(jù)間的CV%需在15%之內(nèi)，允許有一個時間點超限；如果有2個時間點超限可依據(jù)情況舍點取平均值；如果底物剩余<5%，則CV%值沒有限制。如上表所示，該次試驗符合體外代謝穩(wěn)定性的試驗要求，是正常代謝的情況?？梢钥闯觯撍幬镌诟挝⒘ｓw中的半衰期是5.54min，體外固有清除率為250μL/mg/min。

2. 藥物在肝微粒體中不代謝

某次在進(jìn)行肝微粒體藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性結(jié)果統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，藥物的剩余量基本沒有變化，可認(rèn)為該藥物在肝微粒體中沒有發(fā)生代謝。排除產(chǎn)品本身質(zhì)量問題后，可能的原因有：（1）藥物通過非CYP450酶代謝，而該酶在肝微粒體含量很低，活性較弱；（2）該藥物主要代謝途徑是Ⅱ相代謝，可嘗試進(jìn)行Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試驗觀察結(jié)果；（3）該藥物為慢代謝藥物，不適合用肝微粒體代謝模型進(jìn)行試驗。因此，針對Ⅱ相代謝的藥物，客戶可以嘗試使用微粒體進(jìn)行Ⅱ相代謝穩(wěn)定性測試，也可以更換為原代肝細(xì)胞或者肝S9等體外代謝模型。針對肝微粒體中該藥物代謝酶活性低的情況，則需要選擇原代肝細(xì)胞或者肝S9等模型進(jìn)行測試。而針對慢代謝藥物，常規(guī)的微粒體和肝細(xì)胞代謝模型無法滿足試驗要求，可以選擇肝細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行試驗。

3. 酶活問題

如上表所示，在進(jìn)行肝微粒體Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試驗時發(fā)現(xiàn)，藥物在10min后的代謝情況不明顯，代謝趨于平緩，從而在進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合時線性關(guān)系不佳（R2=0.7359＜0.9）。出現(xiàn)該情況可能的原因有：（1）酶活問題。代謝該藥物的酶在肝微粒體中的含量較低，活性較弱，因此在10min后，藥物的代謝趨于平緩，呈現(xiàn)出基本不代謝的情況。此時可嘗試適當(dāng)提高體系中微粒體蛋白的濃度再嘗試一下（建議體系中的蛋白濃度≤1mg/mL，蛋白濃度過高會和藥物發(fā)生非特異性結(jié)合）。（2）產(chǎn)品問題或者批間差異。產(chǎn)品本身質(zhì)量問題或者批次間的差異所致，可更換不同批次的肝微粒體產(chǎn)品進(jìn)行試驗。因此，發(fā)生該情況后可進(jìn)行重復(fù)驗證，以找到出現(xiàn)該問題的原因。

4. 檢測方法或者處理溶劑問題

在實際操作中，可能會遇到這樣一種情況：隨著孵育時間的延長，在某個時間點后，底物的剩余量反而增多，如圖上表中的數(shù)據(jù)一樣，在第10min時，底物剩余量為97%，第15min時，底物剩余量增至105%，之后達(dá)到了123%，針對這一“反常"情況，我們分析可能的原因有：（1）檢測方法問題。檢測方法不合適，底物中包含了代謝產(chǎn)物的峰，導(dǎo)致峰面積變大，此時需要優(yōu)化檢測方法。（2）處理溶劑問題。在終止反應(yīng)時所用的有機(jī)溶劑不合適，可嘗試更換終止液（如由乙腈更換為甲醇等）。

綜上所述，代謝穩(wěn)定性是影響化合物暴露量和生物利用度的主要因素之一，在藥物的有效性和安全性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，在藥物研發(fā)初期，進(jìn)行體外代謝穩(wěn)定性試驗對于預(yù)測人體內(nèi)清除率、篩選優(yōu)勢化合物及構(gòu)建IVIVE模型等方面具有重要意義。

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開發(fā)了一款專門用于Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，符合Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究試驗要求，實驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。除試劑盒外，IPHASE 還可提供人、猴、犬、大鼠及小鼠等不同種屬的的肝微粒體和原代肝細(xì)胞，助力廣大客戶進(jìn)行藥物代謝穩(wěn)定性研究。

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