體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)

微核試驗(yàn)是遺傳毒性研究標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)之一，在食品，化學(xué)品，藥品，農(nóng)藥，飲用水等多類產(chǎn)品的遺傳毒性評價(jià)方面得到廣泛應(yīng)用。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比，體外微核試驗(yàn)更加簡單快速，避免動物個體差異影響，靈敏度高。體外微核試驗(yàn)主要包括體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)，人外周血淋巴細(xì)胞微核試驗(yàn)，肝原代細(xì)胞微核試驗(yàn)等類別。

體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)是一種用于檢測哺乳類細(xì)胞在受試物處理后是否產(chǎn)生微核的遺傳毒性檢測方法。該試驗(yàn)適用于檢測有絲分裂細(xì)胞暴露于受試物期間或之后致染色體斷裂和誘發(fā)非整倍體的能力。如果3h~6h短期處理的試驗(yàn)結(jié)果為陰性或不確定時(shí)，需要進(jìn)行無代謝活化系統(tǒng)的長期處理試驗(yàn)，相當(dāng)于用受試物處理細(xì)胞1.5個~2.0個正常細(xì)胞周期。

參考導(dǎo)則：

GB 15193.28-2020 食品安全-國家標(biāo)準(zhǔn) 體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)

一、儀器、試劑

儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、正置顯微鏡、超凈臺、離心機(jī)。

代謝活化系統(tǒng)

1.1 S9輔助因子的配制

1）  鎂鉀溶液

氯化鎂1.9 g和氯化-鉀6.15 g加蒸餾水溶解至100 ml。

2）  0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)

磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄，28.4 g/L)440 mL,磷酸二氫鈉(NaH₂PO_4·H2O,27.6 g/L)60 mL，調(diào)pH 至7.4，0.103 MPa 20 min滅菌或?yàn)V菌。

3）  輔酶-Ⅱ(氧化型)溶液

無菌條件下稱取輔酶-Ⅱ，用無菌蒸餾水溶解配制成0.025mol/L溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4）  葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液

稱取葡萄糖-6磷酸鈉鹽,用蒸餾水溶解配制成0.05 mol/L 溶液，過濾滅菌。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 大鼠肝S9組分的誘導(dǎo)和配制

選健康雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g~200g，約5周齡~6周齡。將多氯-聯(lián)-苯(Aroclor 1254)溶于玉米油中，濃度為200 g/L，按500 mg/kg體重?zé)o菌操作一次腹腔注射，5 d后處死動物，處死前禁食12 h。

也可采用苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備，經(jīng)口灌胃給予大鼠苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮，劑量均為80 mg/kg體重，連續(xù)3d，禁食16 h后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)。

S9組分制成后，經(jīng)無菌檢查，測定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過40 mg為宜，并經(jīng)間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于-80°C低溫或冰凍干燥，保存期不超過1年。

1.3  S9混合液的制備

S9混合液濃度一般為1%~10%，實(shí)際使用濃度可由各實(shí)驗(yàn)室決定，但需對其活性進(jìn)行鑒定，必須能明顯活化陽性對照物，且對細(xì)胞無明顯毒性。

一般由S9組分和輔助因子按1:9組成10%的S9混合液，無菌現(xiàn)用現(xiàn)配。10%S9混合液10mL配制方法如下:取上述磷酸鹽緩沖液6.0 mL、鎂鉀溶液0.4 mL、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液1.0 mL、輔酶 II溶液1.6 mL、肝S9組分1.0 mL，混勻，置冰浴中待用。

1.4  肌動蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素B(CytochalasinB，cytoB)溶液

用二甲基亞砜( DMSO)配制適當(dāng)濃度的儲備液，避光冷藏保存。cytoB的終濃度通常為3μg/ mL ~6μg/mL，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)各種細(xì)胞系選擇cytoB的適當(dāng)終濃度，以達(dá)到理想的雙核細(xì)胞出現(xiàn)頻率。

1.5  0.075 mol/L氯化-鉀溶液

5.59 g氯化-鉀加蒸餾水至1000 ml。

1.6  固定液

甲醇:冰醋酸為3:1，臨用前配制。

1.7  姬姆薩(Giemsa)染液

取姬姆薩染料3.8 g ，置乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 mL，待*溶解后，再加 125 mL甘油，放入37° C溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，2周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時(shí),取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)混合,配成其應(yīng)用液.現(xiàn)配現(xiàn)用。

磷酸鹽緩沖液(1/15 mol/L，pH 6.8)配制方法如下：

1）一液：取磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)9.47 g溶于1000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；

2） 二液：取磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )9.07 g溶于1 000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；

3） 取一液50 mL加于二液50 ml中混勻，即為pH 6.8的1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液。

二、 試驗(yàn)方法

2.1受試物

固體受試物應(yīng)溶解于適合的溶媒中，并稀釋至適當(dāng)濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當(dāng)濃度使用。受試物應(yīng)無菌現(xiàn)用現(xiàn)配，否則須確認(rèn)儲存不影響其穩(wěn)定性。

2.2 細(xì)胞

可選用中國倉鼠肺細(xì)胞株(V79、CHL)或卵巢細(xì)胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤細(xì)胞株(L5178Y)、人外周血淋巴細(xì)胞株(如TK6)和原代培養(yǎng)細(xì)胞。推薦使用CHL或L5178Y細(xì)胞株。細(xì)胞在使用前應(yīng)進(jìn)行染色體數(shù)目穩(wěn)定性和有無支原體污染的檢查。匯智泰康體外微核試驗(yàn)試劑盒推薦使用中國倉鼠肺細(xì)胞株（CHL）。

2.3試驗(yàn)方案選擇

試驗(yàn)分為使用和不使用cytoB兩種方案。

方案一：在細(xì)胞經(jīng)過受試物處理，有絲分裂前使用cytoB，然后觀察分析已完成一次有絲分裂的細(xì)胞(雙核細(xì)胞)微核率。當(dāng)選用人類淋巴細(xì)胞時(shí),建議采用方案一，因?yàn)椴煌瑏碓吹募?xì)胞周期不同，而且不是所有的細(xì)胞都對植物血球凝集素(PHA)有反應(yīng)。

方案二：不使用cytoB，細(xì)胞經(jīng)過受試物處理后觀察分析細(xì)胞微核率。如果有證據(jù)表明受試物干擾cytoB的活性，或cytoB可能影響細(xì)胞的生長(如小鼠淋巴瘤細(xì)胞株)，建議采用方案二。

2.4 劑量

1） 劑量設(shè)置

至少應(yīng)設(shè)置3個檢測劑量。受試物沒有細(xì)胞毒性時(shí)，從高劑量往下設(shè)至少2個劑量，一般情況下間隔系數(shù)可為2~3；有細(xì)胞毒性時(shí)，其劑量范圍應(yīng)涵蓋從55%士5%的細(xì)胞毒性到幾乎無細(xì)胞毒性。

2） 高劑量的選擇

決定高劑量的因素是細(xì)胞毒性、受試物的溶解度以及pH、滲透壓。

受試物有細(xì)胞毒性時(shí)，高劑量應(yīng)能引起55%士5%的細(xì)胞毒性；如果沒有細(xì)胞毒性或沉淀，高劑量應(yīng)是5 μL/mL、5 mg/ml或10 mmol/L。

對溶解度較低的物質(zhì).當(dāng)達(dá)到大溶解濃度時(shí)仍無毒性，則高劑量應(yīng)是在終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應(yīng)使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。

3） 細(xì)胞毒性的確定，

在S9存在和不存在兩種條件下依據(jù)細(xì)胞完整性和生長情況的指標(biāo)來確定細(xì)胞毒性。

方案一，使用cytoB，細(xì)胞毒性的確定可依據(jù)復(fù)制指數(shù)(ReplicationIndex,RI)或胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)( Cytokinesis Block Proliferation Index,CBPD)。

4） 陽性對照

陽性對照物包括染色體斷裂劑和非整倍體劑。加S9時(shí)，斷裂劑可以選用環(huán)磷酰胺和苯并(a)芘；不加S9時(shí)，斷裂劑可以選用阿糖胞苷、si裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍體劑只用于不加S9時(shí)，可以選用秋水仙素和長春新堿。

如果短期處理試驗(yàn)方案在S9存在和不存在兩種條件下都選用斷裂劑作為陽性對照，那么長期處理試驗(yàn)方案應(yīng)該選用非整倍體劑作為陽性對照。如果選用的細(xì)胞本身具有代謝能力，則不需要另外添加S9，陽性對照應(yīng)該同時(shí)使用斷裂劑和非整倍體劑。

5） 陰性對照

溶媒必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響組胞存活和S9活性。優(yōu)先選溶媒是培養(yǎng)液(不含血清)或水。使用水作為溶媒時(shí)其體積不應(yīng)大于總體積的10%。DMSO也是常用溶媒，但終濃度不應(yīng)大于1%。

6） 空白對照

如果沒有文獻(xiàn)資料或歷史資料證實(shí)所用溶媒無致突變作用時(shí)應(yīng)設(shè)空白對照

2.5試驗(yàn)步驟

1） 細(xì)胞準(zhǔn)備

將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿(瓶)中，以收獲細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)皿(瓶)的細(xì)胞未長滿為標(biāo)準(zhǔn)，貼壁細(xì)胞一般以長到85%左右為佳。

2） 受試物處理

應(yīng)用方案一，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液及一定濃度的受試物(需代謝活化者同時(shí)加人S9 mix)，置于培養(yǎng)箱中3h~6h；結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞，加人含10%血清的新鮮培養(yǎng)液和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)1.5個~2.0個正常細(xì)胞周期后收集細(xì)胞。

對于淋巴細(xì)胞，有效的方法是在有絲分裂原(如PHA)刺激后44h~48h開始受試物處理，這時(shí)細(xì)胞開始進(jìn)入分裂周期。

如果3h~6h短期處理的試驗(yàn)結(jié)果為陰性或不明確時(shí)，需要進(jìn)行無S9的長期處理試驗(yàn)，用cytoB和受試物處理細(xì)胞1.5個~2.0個正常細(xì)胞周期，在處理結(jié)束后收集細(xì)胞。

如果已知或懷疑受試物(如核苷類物質(zhì))可能影響細(xì)胞周期(特別是P53活性細(xì)胞)，則細(xì)胞收獲時(shí)間應(yīng)該再延長1.5 個~2.0個正常細(xì)胞周期。

應(yīng)用方案二，與應(yīng)用方案一處理方法相同，只是不加cytoB。

3） 收獲細(xì)胞與制片

每次培養(yǎng)都應(yīng)單獨(dú)收獲細(xì)胞和制片，如果細(xì)胞混合液的分散度良好則不需要進(jìn)行低滲處理。

a、消化

貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待細(xì)胞脫落后，加入含10%胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放人離心管以800r/min~1 000r/min的速度離心5 min，棄去上清液。懸浮細(xì)胞不需要消化，直接離心。.

b、低滲

加入0.075 mol/L氯化-鉀溶液2 mL，用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻，放人37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中低滲處理 1 min~5 min.

固定

加入2 mL固定液，混勻后固定5 min以上，以800 r/min~1 000 r/min的速度離心5 min，棄去上清液。重復(fù)一次，棄去上清液。

c、滴片

加人數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。

d、染色

推薦用姬姆薩染色(5% ~10%姬姆薩染液，15 min~ 20 min),，也可用DNA特異性熒光染料(如: 吖啶橙或Hoechst  33258)。

如果需要區(qū)分染色體斷裂劑和非整倍體誘變劑，可用熒光原位雜交(FISH)或引物原位標(biāo)記等方法。

4） 閱片

a、微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：微核一般為圓形或橢圓形，直徑不超過主核的1/3；與主核在一個焦點(diǎn)平面上，與主核的顏色、結(jié)構(gòu)特征及折光性一致；與主核之間沒有核物質(zhì)相連，可以和主核有邊界的重疊，但能看清各自的核膜。

b、應(yīng)用方案一，每個劑量組至少分析2000個雙核細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞率(一個雙核細(xì)胞不論含有幾個微核，都只算作一個含微核細(xì)胞)。如果單次培養(yǎng)可供計(jì)數(shù)的雙核細(xì)胞數(shù)少于2000，則應(yīng)采用多次細(xì)胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)。對不規(guī)則的雙核細(xì)胞(如兩個核大小相差懸殊)和多于兩個核的細(xì)胞不進(jìn)行分析。

c、應(yīng)用方案二，每個劑量組至少分析2 000個細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞率。如果單次培養(yǎng)可供計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)少于2000，則應(yīng)采用多次細(xì)胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)。

三、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定

3.1 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)按不同劑量列表，指標(biāo)包括細(xì)胞毒性、觀察細(xì)胞數(shù)、含微核細(xì)胞數(shù)及微核細(xì)胞率。受試物各劑量組與空白對照組、陰性對照組(溶媒對照組)、陽性對照組的微核細(xì)胞率用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法(如X²檢驗(yàn))進(jìn)行處理。

3.2結(jié)果判定

下列兩種情況可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽性結(jié)果；

a)受試物引起微核細(xì)胞率的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并與劑量相關(guān);

b) 受試物在任何一個劑量條件下，引起的微核細(xì)胞率增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性。

四、試驗(yàn)解釋

陽性結(jié)果表明受試物在該試驗(yàn)條件下可引起所用哺乳類細(xì)胞染色體損傷，微核細(xì)胞率增加。陰性結(jié)果表明在該試驗(yàn)條件下受試物不引起所用哺乳類細(xì)胞染色體損傷。評價(jià)時(shí)應(yīng)綜合考慮生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

體外微核試驗(yàn)試劑盒

北京匯智泰康針對體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)開發(fā)體外微核試驗(yàn)試劑盒，本試劑盒提供了進(jìn)行體外哺乳類細(xì)胞微核試驗(yàn)所需的主要試劑和細(xì)胞，快速檢測受試物是否有導(dǎo)致染色體斷裂和誘發(fā)非整倍體的情況，從而評價(jià)受試物的遺傳毒性，試劑盒的使用可以大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)人員的準(zhǔn)備時(shí)間。

【產(chǎn)品組成】

5mL×32體系/盒。

【產(chǎn)品使用說明】

1、細(xì)胞復(fù)蘇

收到試劑盒后，請盡快復(fù)蘇細(xì)胞。

從-70冰箱取出細(xì)胞，于37℃水浴融化，離心，棄上清，用含10%牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-10）中重懸細(xì)胞后，再次離心；棄上清，用RPMI-10重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后期細(xì)胞傳代比例為1:3。

2、細(xì)胞準(zhǔn)備

將處于對數(shù)生長期，貼壁生長良好的細(xì)胞用胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化處理制成細(xì)胞懸液，5mL/瓶接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)約24 h-48h。

3、染毒處理

吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中處理3h。棄去處理液，使用PBS洗滌細(xì)胞2~3次，換液后，按1%的比列加入細(xì)胞松弛素B（如4.95mL RPMI-10+0.05mL cytoB）。具體試驗(yàn)方案見下表

1）10%S9混合液配制

2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案

3）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案

注：24h染毒的陽性底物需將si裂霉素C稀釋5倍后再使用。由于CytoB使用DMSO溶解的，按照食品標(biāo)準(zhǔn)，陰性對照的有機(jī)溶劑含量不得超過1%，若受試物需用有機(jī)溶劑溶解，樣品制劑的有機(jī)溶劑含量不得超過70%。

4、收獲細(xì)胞及制片

用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，加入0.075mol/L氯化-鉀溶液進(jìn)行低滲處理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，可適當(dāng)調(diào)整冰醋酸濃度，但不宜過大）進(jìn)行固定并滴片，用吉姆薩染液染色，中性樹膠封片，并于油鏡下進(jìn)行閱片，每處理組計(jì)數(shù)500個細(xì)胞中的增值指數(shù)CBPI和細(xì)胞復(fù)制指數(shù)RI，計(jì)算出細(xì)胞毒性；每一劑量組應(yīng)分析不少于2000個核型相差不大的雙核細(xì)胞，計(jì)算微核率。

5、數(shù)據(jù)分析計(jì)算

6、結(jié)果判定

下列兩種情況可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：

1. 受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并與劑量相關(guān)；
2. 受試物在任何一個劑量條件下，引起的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性。

細(xì)胞毒性=1-RI

【注意事項(xiàng)】

實(shí)驗(yàn)前請自行準(zhǔn)備RPMI 1640培養(yǎng)液、牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.075mol/L氯化-鉀溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆薩染液、胰蛋白酶、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、15、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。

匯智泰康是一家位于中美兩地的生物醫(yī)藥合同研發(fā)機(jī)構(gòu)，整合中美兩地的藥物研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證，面向企業(yè)及研發(fā)機(jī)構(gòu)提供分析化學(xué)、DMPK、藥理藥效、生物學(xué)、以及毒理安全性評價(jià)產(chǎn)品與服務(wù)。